外泌体在口腔疾病中的研究进展

外泌体（exosomes）是一类直径大小介于40～100nm的膜性脂类囊泡，它含有多种具有生物活性的RNA、miRNA、DNA和蛋白等，是细胞之间发生信号传导的重要介质。外泌体可以由大多数细胞（如上皮细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞、免疫细胞等）分泌，也广泛存在于唾液、尿液、血液、脑脊液、乳汁等体液中。

外泌体已经被发现在肿瘤疾病中具有抗肿瘤免疫、早期诊断等作用，对组织（如心、肝、脑、肾等）损伤也有修复作用。近年来，研究发现外泌体与口腔疾病也存在密切联系，本文就外泌体在口腔疾病中的研究进展作一简要综述。

1.外泌体的形成

外泌体的形成，首先是由分泌细胞的细胞膜向内凹陷，并在高尔基复合体的加工下形成早期核内体，然后包裹胞浆内的miRNA、mRNA及DNA等形成成熟核内体，然后在粗面内质网和高尔基复合体的加工下形成多囊泡体（multivesicular body，MVB），一部分MVB被细胞溶酶体降解，一部分MVB与细胞膜融合，通过胞吐方式向细胞外释放即外泌体。

外泌体的组成主要包括细胞膜融合蛋白和转运相关蛋白，如Annexin和Rab蛋白；热休克蛋白，如Hsp70、Hsp84和Hsp90等；信号转导蛋白，如蛋白激酶、异源三聚体G蛋白；以及含有可与包括MHC分子和整合素等多种蛋白质相互作用的四分子交联体超家族，如CD63、CD9、CD81等。

2.外泌体的生物学功能

外泌体的生物学功能与其来源的母体细胞密切相关，不同来源的细胞其功能不同，主要特征性功能如下。

2.1清除细胞成熟过程中的代谢蛋白

外泌体最早被认为是细胞代谢的“垃圾”，后来被发现在红细胞成熟过程中可以清除多余的转铁蛋白受体和乙酰胆碱酯酶。研究显示红细胞在成熟过程中向外环境释放外泌体，外泌体中转铁蛋白受体与热休克蛋白HSP70相互作用，从而使转铁蛋白受体从红细胞表面消失。

2.2介导细胞间的信息交流

不同细胞释放的外泌体大部分均携带丰富的母体细胞膜表面蛋白，能与不同的细胞膜表面受体配对，在细胞之间没有直接接触的情况下，通过膜表面的受体－配体高效率的结合，进行细胞间的信号传导。例如树突状细胞来源的外泌体，通过其膜表面的蛋白复合物（如热休克蛋白、四跨膜蛋白等）与靶细胞膜表面的相应受体进行相互作用，从而触发了T淋巴细胞的免疫活性。另外，外泌体也可以将所携带的具有生物活性的蛋白质及RNA、miRNA等通过直接与靶细胞细胞膜融合后释放到靶细胞内，参与细胞的调控。此外，外泌体亦可以通过胞吞的方式整体进入靶细胞内，从而进行细胞间的信息传递。

2.3免疫耐受

外泌体由于体积小不易被机体免疫细胞识别和清除，从而呈现出低免疫状态。如树突状细胞是免疫系统中的重要细胞，研究表明由未成熟的树突状细胞释放的外泌体，被认为是介导自身免疫耐受的重要中介之一。研究发现在大鼠骨髓移植前7d或14d，将供体骨髓中树突状细胞产生的外泌体注射给受体，可以显著延长异体移植的大鼠心脏存活时间。此外，体外实验也观察到接受外泌体治疗的受体内CD4+T细胞显著减少，该结果说明了免疫耐受现象的存在。

2.4靶向性

外泌体与靶细胞的受体－配体高效率结合有助于外泌体的远距离运输，外泌体可作为靶向药物输送系统使用。外泌体作为药物的天然内源性载体具有独特的优势，如其免疫原性低、稳定性高、向细胞运输的效率高、有更强的增强渗透滞留效应等。然而，不同类型细胞分泌的外泌体特点也有不同，例如相比于其他分泌细胞，树突状细胞分泌的外泌体表面会表达CD9，这种蛋白有利于加强外泌体与靶细胞的融合从而提高外泌体对药物运输的效率。

3.外泌体在口腔疾病中的相关研究

口腔疾病主要包括牙体、牙周、口腔颌面外科和口腔黏膜病等，诊断和治疗方法繁多，但是各有利弊。因此，探索新的诊断技术和治疗方法一直是口腔医学研究人员关注的热点。外泌体在口腔疾病的研究中从最初主要集中在口腔肿瘤和自身免疫性口腔黏膜疾病，到现在已经扩展到口腔上皮间充质转化、牙周免疫和口腔组织再生等方面，这说明外泌体在口腔领域的潜在应用价值正在被引起重视。

3.1口腔肿瘤

口腔癌患者占全世界所有癌症病例的2%～4%，其中男性的发病率和死亡率（分别为2.3%和1.7%）高于女性（1.2%和0.8%）。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔癌中最常见的口腔肿瘤。研究发现在早期被检测治疗的口腔鳞状细胞癌5年生存率可以达到60%～80%。目前，临床对肿瘤的诊断主要靠病理诊断，有些早期还未形成临床诊断的病变很难被及时诊断。因此，早期诊断OSCC是很有临床意义的。

Zlotogorski-Hurvitz等学者分别从口腔癌患者和健康个体中分离出唾液来源的外泌体，通过比较它们的形态、分子间差异，发现口腔癌患者唾液中分离的外泌体四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）的表达与健康个体存在明显差异，CD81和CD9下降，CD63上升，这种差异提示外泌体可作为早期诊断的标志物。同时，唾液中外泌体的获取相比传统病理组织取材是简单无损害的，唾液中的外泌体标记物检测可能对临床上不能鉴别的早期肿瘤进行诊断。研究统计经过治疗的OSCC患者的复发率，结果显示肿瘤复发率为15%～33%，并且肿瘤病人的复发治疗难度相比初次治疗要大。因此，有必要预测哪些OSCC病人是最有风险复发的，但是临床上目前尚无比较理想的预测手段。

Hou等学者研究发现肿瘤衍生的外泌体增加了腺样囊性癌细胞的迁移和侵袭能力，而腺样囊性癌细胞株SACC-83衍生的外泌体被宿主细胞吸收，增强了内皮细胞的渗透性，还证明了细胞连接相关蛋白（claudins和ZO-1）的表达是下调的，这可能与肿瘤衍生的外泌体介导的侵袭、转移有关。唾液腺的上皮－间质相互作用主要由生长因子和细胞外基质调控，Hayashi等学者发现含有间质特异性成熟miRNA的外泌体，可为间质到上皮的转化提供遗传信号，成熟的间质中的mir-133b-3p可通过外泌体从间质转移至上皮细胞中，从而确认了miRNA的失调是体内癌细胞扩散的特征标志。

由此可见，外泌体在肿瘤的复发转移中可能发挥作用，这提示肿瘤细胞来源的外泌体有望成为肿瘤病情监测、疗效评估的新型生物标志物，其脂质双分子层膜结构对其内容物起到了很好的保护作用，可防止内容物被血液循环中酶类物质降解，从而具有更高的稳定性，且外泌体体积较小，通透体内组织屏障能力较强，更易到达各种体液，为液体活检提供了重要的前提。

唾液是一种简单易获取的生物液体，不同外泌体中miRNA的组成不同，可用于制造出特定疾病的唾液生物标志物，便于疾病的监测。口腔恶性肿瘤目前最主要的治疗方法是手术、放疗和化疗，但是手术治疗会对吞咽、言语和外貌有显著影响，极大地影响了病人的生活质量，放、化疗的副作用也极大影响患者的身心健康。

口腔肿瘤免疫治疗是目前比较理想的抗肿瘤新疗法，李金等学者的研究发现舌癌Tca8113细胞能分泌外泌体，从Tca8113细胞中分离并纯化外泌体，通过透射电子显微镜观察其超微结构，蛋白质印迹法分析其表面成分，发现Tca8113细胞分泌的外泌体携带有肿瘤抗原，其内含有多种与肿瘤免疫相关的蛋白具有抗肿瘤作用；肿瘤来源的外泌体正在形成抗肿瘤免疫调节剂，同时外泌体可进行大规模工业化生产，这为将来治疗口腔癌提供了新的方法。

3.2牙周病

牙周病是人类口腔常见疾病之一，是一种慢性炎症性疾病。菌斑微生物及其产物的侵袭是牙周病的始动因子，研究已经证实口腔中有30余种细菌与牙周病的发生和发展有关，包括牙龈卟啉单胞菌、伴放线菌嗜血菌、具核梭杆菌等。细菌也可以分泌外泌体，研究发现牙龈卟啉单胞菌来源的外泌体可以抑制牙龈成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖，同时抑制了人脐静脉内皮细胞毛细血管的形成，这提示外泌体可以通过影响牙周组织中的细胞增殖和血管形成来促进牙周炎的进展。

在慢性牙周炎中，细胞之间信号分子的传递可能是局部炎症和全身炎症的重要来源，可能导致牙周易感细胞不需要细胞接触就可以始终暴露在相对高浓度的毒素中，从而引起牙周病。NOD1和NOD2被证明是细菌感染的关键细胞内传感器，通过激活核因子NF-κB诱导免疫应答和消除细菌。NOD1和NOD2在口腔组织中各种细胞类型（如牙龈成纤维细胞、牙周韧带细胞等）中表达。

研究发现A型伴放线杆菌的来源的外泌体可以被人类细胞摄取，并传递部分激活NOD1和NOD2的抗原，有助于细菌外囊泡诱导的整体炎症反应。同时，miRNA是真核生物基因表达的主要调节者，有研究从牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌等细菌中分离了miRNA，并且这些miRNA可通过外泌体被传递到真核生物，这提示外泌体可以参与介导细菌与人之间的相互作用，为牙周致病机制提供新的见解。

3.3口腔黏膜相关疾病

口腔扁平苔藓是一种伴有慢性浅表性炎症的皮肤－黏膜角化异常性疾病，是口腔黏膜病中一种常见疾病，其确切病因不明。其主要临床分型主要分为斑纹型和萎缩糜烂型两种，世界卫生组织已经将口腔扁平苔藓列为癌前病变，尤其是萎缩糜烂型的患者经过治疗仍然经久不愈，应提高警惕。因此，对口腔扁平苔藓应该正确诊断和治疗，并对病例进行定期检测做到癌变的早发现、早治疗。

Byun等通过比较16名口腔扁平苔藓患者和8名健康对照者的唾液miRNA谱，发现miR-4484在口腔扁平苔藓患者的外泌体中显著升高，这提示唾液中的外泌体携带的miRNA可能是口腔扁平苔藓的特异性生物标志。手足口病是一种儿童传染性疾病，又被称为是疱疹性水疱性口腔炎，以手、足和口腔黏膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要的临床表现。Jia等学者研究表明，外泌体的miRNA表达可区分轻微的和极为严重的手足口病。通过对比轻微和严重的手足口患者可发现，3种miRNA（miR-671-5p，miR-16-5p，miR-150-3p）的表达水平有显著差异，表明手足口病在不同的条件下外泌体中的miRNA表达独特的miRNA特征；外泌体的miRNA表达谱可能为诊断和分型手足口病提供生物标志物的鉴定。

3.4口腔组织再生

口腔牙髓疾病的传统治疗方法是以生物材料替代有活力的牙髓组织，牙髓组织再生一直是学者们关注和研究的热点，干细胞作为种子细胞已获得广泛认同，诱导干细胞分化为牙髓组织是一个亟待解决的问题。特异性外泌体可引发干细胞的家系分化，Huang等学者评估了来自牙髓干细胞的外泌体诱导人牙髓干细胞的分化和人类骨髓基质细胞的衍生，结果发现外泌体可与基质蛋白结合，实验表明外泌体触发了牙髓样组织再生，在牙源性条件下分离的外泌体能更好地诱导干细胞分化和组织再生。

另外，有学者分别用普通培养基和成牙本质细胞培养基培养牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs），分别提取培养液中的外泌体，然后将其接种于Ⅰ型胶原膜上形成复合物，再将复合物置于牙根片段内，最后将牙根片段复合物置于裸鼠背部皮下，免疫组化显示实验组成牙本质诱导后DPSCs分泌的外泌体组高表达基质矿化和细胞成牙本质分化的关键调节因子DMP1和DPP。这提示外泌体或其传递的分子可能是治疗口腔疾病或牙体组织再生的介入靶点。

3.5口腔来源的外泌体与全身疾病

外泌体可以来源于口腔唾液、细胞以及细菌等，有研究显示口腔来源的外泌体与远端疾病有密切联系。例如阿尔茨海默病是一种神经退行性病变，目前临床治疗主要以延缓神经退化速度为主。Jarmalaviciute等从人类脱落的乳牙牙髓中提取的干细胞具有神经基因特性，乳牙牙髓干细胞旁分泌对神经再生的重要性已得到认可，但其确切机制尚不清楚，研究表明乳牙牙髓干细胞来源的外泌体可在多巴胺神经元上抑制由6-羟基多巴胺诱导的神经元凋亡，由此表明，从乳牙牙髓干细胞中提取的外泌体可能成为治疗帕金森病的新手段。此外，有研究发现乳腺癌细胞分泌的外泌体可以被口腔唾液腺细胞摄取，改变唾液腺细胞的转录机制，从而改变唾液腺分泌的外泌体的成分，这提示通过检测唾液中外泌体的成分，可以对乳腺癌进行诊断。

4.展望

外泌体是细胞衍生的囊泡，不同细胞来源的外泌体所含的成分不同，可以作为“精准医学”的潜在诊断生物标志物，有利于疾病的早期诊断。外泌体具有抗肿瘤免疫、促进血管新生、促进组织再生等功能，有助于临床上对口腔疾病的早期诊断、治疗以及促进口腔组织再生等。尽管外泌体在口腔疾病中已经引起学者们的关注，但是尚处于起步阶段仍然需要进一步探索研究。口腔唾液作为一种易获取的生物体液，如果未来能彻底透彻研究唾液中外泌体的信息，充分利用唾液来源的外泌体对全身疾病和口腔疾病进行诊断，并且有针对性的利用外泌体进行疾病治疗，这将为临床诊断和治疗提供新思路。

来源：王娟,骆瑜,彭友俭.外泌体在口腔疾病中的研究进展[J].口腔医学,2019,39(10):952-956.

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