牙龈卟啉单胞菌促进口腔鳞状细胞癌发生机制研究进展
口腔癌是指发生于口腔的恶性肿瘤，由于在口腔中90%的恶性肿瘤来源于鳞状细胞，故口腔癌主要指口腔鳞状细胞癌（oral squamousc ell carcinoma，OSCC）。OSCC具有发病率高、5年存活率低、早期症状不明显、易被患者忽视、易发生颈淋巴结转移、预后不良、易复发等特点，在最常见的恶性肿瘤中排名第六。
WHO发布的世界口腔癌发病率和死亡率数据显示，东南亚地区OSCC的发病率最高；当按照经济发达水平分类时，经济发达地区发病率较高，经济欠发达地区死亡率较高。这使得OSCC成为全世界关注和研究的重点。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是革兰阴性厌氧菌，为牙周炎的主要致病菌，具有较强的感染和破坏牙周组织的能力，多在慢性牙周炎患者的龈下菌斑中检出。
P.gingivalis具有许多毒力因子，可黏附定植于口腔组织表面，也可侵入牙周组织中，并进行增殖和扩散。同时，P.gingivalis能够适应宿主环境，逃避宿主免疫系统的杀伤作用。近年来多项流行病学研究发现，P.gingivalis与OSCC之间具有密切联系，显示P.gingivalis具有较强的致癌潜能。本文就P.gingivalis促进口腔上皮细胞增殖、抑制口腔上皮细胞凋亡、促进口腔上皮细胞迁移和侵袭、形成慢性炎性微环境等4个方面，对P.gingivalis促进OCSS发生机制的研究进展做一综述。
1.P.gingivalis与OSCC
OSCC的危险因素主要包括吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒（HPV）感染等，然而仍有15%的OSCC病例不能被上述主要危险因素中的任何一种解释。近20年来，大量研究成果支持了细菌可成为特定肿瘤危险因素的观点，如幽门螺杆菌与胃癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、伤寒杆菌与胆囊癌、脆弱拟杆菌和具核梭杆菌与结肠癌等。在这些研究结果的支持下，关于P.gingivalis与OSCC相关性的研究逐渐增多。
1998年，Nagy等在研究OSCC表面生物膜的微生物成分与含量的过程中发现，OSCC组织表面菌落的种类和数量均明显高于邻近的健康口腔黏膜组织，且在厌氧培养条件下的OSCC组织表面可见大量P.gingivalis菌落。
2011年，Katz等研究OSCC患者病灶组织中P.gingivalis的分布情况时，采用免疫组织化学染色法观察P.gingivalis与链球菌属的表达情况，其中链球菌属因不具有口腔入侵性而作为对照；结果发现，P.gingivalis在健康牙龈组织和OSCC组织中均有出现，但在OSCC组织中含量更高（>33%），且P.gingivalis的染色强度是链球菌属的2倍。P.gingivalis在OSCC组织中的大量定植提示了P.gingivalis与OSCC之间可能存在潜在联系。随着实验技术的不断发展，高通量技术也被用于分析P.gingivalis与OSCC间的关系。
Pushalkar等采用16SrRNA技术和宏基因组学技术分析细菌在OSCC患者唾液中的多样性和相对丰度时发现，244个细菌物种在OSCC组织样本中惟一表达，398个细菌物种在对照健康组织样本中惟一表达；对比两种样本共同表达的细菌种类后可发现，相对于健康组织来说，包括P.gingivalis在内的诸多细菌在OSCC组织中含量更为丰富。以上研究均证明了P.gingivalis与OSCC之间可能存在潜在联系，尽管目前仍缺少强有力的流行病学研究证明，但对于P.gingivalis致癌机制的相关研究已显示了其在促进OSCC发生方面具有强大的潜力。
2.P.gingivalis可能的致癌机制
2.1P.gingivalis促进口腔上皮细胞增殖
癌细胞具有强大的增殖潜能，P.gingivalis感染口腔上皮细胞后可通过多种途径调控细胞周期，进而提升癌细胞增殖潜能。
2.1.1细胞周期蛋白途径
细胞周期蛋白（cyclin）是一种瞬时表达的核蛋白，可激活同源的细胞周期素依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）并与之形成复合体促进细胞周期进程。2008年，一项蛋白质组学分析研究显示，P.gingivalis感染口腔上皮细胞后，大量调控细胞周期的蛋白质在表达水平和磷酸化状态上发生改变，调控通路主要涉及cyclin和肿瘤抑制基因p53。
研究数据显示，在P.gingivalis感染的口腔上皮细胞中cyclinA、CDK4、CDK6表达上调，加速细胞周期运转，其中cyclinA负责调控G1/S和G2/M期过渡，CDK4和CDK6负责调控G1/S期过渡；同时cyclinD和CDK抑制剂INK4表达下调，解除对细胞周期的抑制，其中INK4通过抑制CDK4和CDK6诱导细胞周期停滞在G1或G2期，cyclinD负责抑制G1/S期过渡。
在随后的细胞培养中也发现，感染P.gingivalis的口腔上皮细胞通过G1期进入S/G2期时，未感染P.gingivalis的正常对照组细胞仍停留在G0/G1期。Pan等对上述研究结果进行了补充，通过建立P.gingivalis感染永生化口腔上皮细胞模型，发现在感染P.gingivalis6~12h后的口腔上皮细胞中cyclinE表达上调，并通过促进G1/S期过渡显著提高细胞增殖。
2.1.2p53途径
肿瘤抑制基因p53主要参与了DNA损害和染色体畸变，若干激酶（如CHK2、AuroraA、CK1δ、CK1ε等）可通过磷酸化方式活化p53，活化后的p53可使细胞周期停滞，修复损伤DNA，促进细胞凋亡。然而在口腔上皮细胞中，P.gingivalis可使上述激酶的表达全部下调，而少量表达的p53被Ser392通过磷酸化作用抑制，使得p53无论在表达水平还是活性上均被抑制，从而解除对细胞周期的抑制，提高细胞增殖速率。
2.1.3P.gingivalis的特殊结构
有研究通过对野生型P.gingivalis与菌毛突变株P.gingivalis的转录性能进行对比分析后发现，P.gingivalis的长菌毛结构激活了超过200个与细胞周期相关基因的表达，经细胞色素氧化酶荧光测定法分析，感染野生型P.gingivalis的口腔上皮细胞的增殖速率是感染菌毛突变株P.gingivalis口腔上皮细胞的2倍。此外，自从细菌的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）被报道可异常调节p53后，Tang等研究并确认了P.gingivalis的LPS也可异常调节p53，并通过影响其下游炎性基因的表达促进细胞增殖。
2.1.4其他
β连环蛋白通路是调控细胞增殖和肿瘤形成的一条重要通路。研究发现，P.gingivalis可通过牙龈素依赖的蛋白水解作用分解β连环蛋白破坏复合体，从而活化β连环蛋白，发挥其促进细胞增殖的作用。
2.2P.gingivalis抑制口腔上皮细胞凋亡
癌细胞不仅具有强大的增殖潜力，还能抑制自身凋亡。大量研究发现，P.gingivalis可通过多种途径抑制细胞凋亡：
（1）P.gingivalis可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路抑制口腔上皮细胞凋亡，PI3K使Akt发生磷酸化，活化的Akt可激活核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）的表达、抑制半胱氨酸蛋白酶-3（caspases-3）的活化从而抑制口腔上皮细胞凋亡。
（2）P.gingivalis还可通过Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路来抑制口腔上皮细胞凋亡，JAK/STAT信号通路是口腔上皮细胞固有的线粒体凋亡通路，该通路不依赖菌毛结构发挥作用，P.gingivalis刺激JAK使STAT发生磷酸化作用，促进STAT二聚化，进而抑制细胞色素c的释放，提高B淋巴细胞瘤/白血病-2蛋白（Bcl-2）的活性，抑制caspases-3的表达，从而抑制细胞凋亡。
（3）P.gingivalis通过Akt信号通路使促凋亡蛋白BAD磷酸化，被磷酸化的BAD从二聚复合物上分离，形成抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xL蛋白，其可抑制线粒体膜上BAD的活性，导致线粒体膜上的抗凋亡因子Bcl-2与促凋亡因子Bcl-2相关x蛋白（Bax）的比值提高，使得下游caspase-9和caspase-3等的活化被抑制，进而抑制细胞凋亡。
（4）P.gingivalis通过上调miRNA-203的表达来抑制细胞因子信号传导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）的活性，促进信号转换，增强STAT3的表达，进而抑制细胞凋亡。
（5）P.gingivalis可分泌核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDK）同系物蛋白，分解胞外腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），阻止ATP与嘌呤受体P2X7结合，从而抑制P2X7介导的ATP依赖性细胞凋亡。此外，NDK能够干扰树突细胞P2X7受体通过ATP活化作用引起的抗癌免疫反应。
（6）最新研究表明，在P.gingivalis的LPS上，O抗原在抑制细胞凋亡作用上也发挥了巨大的作用，同时还能增强Toll样受体4（toll-like receptors 4，TLR4）的表达。
（7）Binder等研究发现，在同时感染P.gingivalis和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）的小鼠牙周炎模型中，可通过白介素6（interleukin-6，IL-6）/STAT3信号通路促进口腔癌形成。
2.3P.gingivalis促进口腔上皮细胞迁移和侵袭
P.gingivalis在促进迁移和侵袭方面的研究主要包括促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达和促进口腔上皮细胞发生间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）两方面。
（1）P.gingivalis分泌的牙龈素激活酶原后，通过活化细胞外调节蛋白激酶-转录因子Ets1（ERK1/2-Ets1）、P83蛋白/热休克蛋白27（P83/HSP27）和蛋白酶激活受体2/核因子kB（PAR2/NF-kB）通路上调基质金属蛋白酶前体9的表达，促进细胞的侵袭和远端转移。P.gingivalis主要通过提高酶原的表达水平和随后的活化水平来加强细胞的侵袭能力。最新研究还显示，P.gingivalis的LPS对上皮屏障中紧密连接蛋白的破坏作用也参与了细胞的迁移和侵袭。
（2）长期重复暴露在P.gingivalis中的口腔上皮细胞会逐渐减少上皮细胞标记物的表达，使其获得EMT表型，增加CD44和CD133等癌细胞标记物的表达，促进口腔上皮细胞的迁移和侵袭；除此之外，P.gingivalis感染的OSCC细胞还能通过分泌IL-8刺激释放MMP-1和MMP-10，进而促进癌细胞的侵袭。
2.4P.gingivalis形成慢性炎性微环境及免疫逃避
慢性炎症反应主要由感染或环境因素引起，在肿瘤发生发展的所有阶段均发挥了重要的作用。P.gingivalis通过多种途径介导慢性炎症的形成。
（1）P.gingivalis感染口腔上皮细胞后，刺激炎性细胞产生活性氧、活性氮中间体、炎性细胞因子等产物，这些产物通过引发DNA损伤、降低基因稳定性、引起表观遗传学改变等方式促进突变的积累，继而促进细胞癌变。
（2）感染P.gingivalis的口腔上皮细胞通过上调IL-1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达，继而活化关键转录因子STAT3和NF-kB，促进了癌前细胞的增殖、血管的形成，以及癌细胞的侵袭和远端转移，并在肿瘤微环境中形成慢性炎症。
（3）P.gingivalis通过上调程序性死亡配体1和程序性死亡配体2受体来促进免疫逃避反应，进而引发慢性炎症。一项最新研究还显示，P.gingivalis可通过干扰巨噬细胞的迁移，抑制其吞噬凋亡的中性粒细胞，从而促进慢性炎症形成。
3.总结
综上，尽管P.gingivalis与OSCC的具体关系缺少强有力的流行病学证据，但P.gingivalis在促进口腔上皮细胞增殖、抑制口腔上皮细胞凋亡、促进口腔上皮细胞迁移和侵袭、形成慢性炎性微环境等方面展现了强大的致癌潜能。对P.gingivalis与OSCC的关系和具体机制的深入研究具有重大意义，可为OSCC的防治提供更可靠的理论依据和应用指导。
来源：鲁泽,潘亚萍.牙龈卟啉单胞菌促进口腔鳞状细胞癌发生机制研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2019,12(10):617-621.
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